我国正式启动“非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗”研究项目

 

公共安全专项“非洲猪瘟等外来动物疫病防控科技支撑”项目启动暨实施方案论证会在青岛召开

 

1月12日,公共安全专项“非洲猪瘟等外来动物疫病防控科技支撑”项目启动暨实施方案论证会在青岛召开。科技部农村司、农业农村部科教司、中国21世纪议程管理中心、中国农科院、中国动物卫生与流行病学中心、实施方案论证专家组成员,项目负责人、课题负责人以及各参与单位的主要研究人员等参加会议。
 

会上,项目首席汇报了总体任务目标、研究内容、年度计划与实施方案等内容。专项咨询专家组组长高福院士等针对项目存在的问题与不足提出具体指导意见,并就项目的任务落实、组织管理、资源共享和经费使用等方面进行了充分讨论,进一步明确研究任务和要求,为项目任务的顺利完成奠定良好的基础。
 

科技部农村司蒋丹平副司长表示,当前,非洲猪瘟疫情防控形势严峻,党中央、国务院高度重视当前疫情防控情况,项目承担单位要进一步提高政治站位,抓好联合攻关,围绕攻关目标,加快研究进程,为有效控制和扑灭非洲猪瘟重大疫情提供强有力的科技支撑。一是要强化组织统筹,做好服务保障;二是要做好强化基础研究、强化流行病学研究、强化联合攻关、强化成果应用转化、强化科研布局等“五个强化”,建立好研发支撑体系、疫情防控体系等“两个体系”,提升非洲猪瘟防控能力和水平;三是围绕问题导向,完成好应急使命。农业农村部科教司张文副司长、中国21世纪议程管理中心黄晶主任分别在会上提出要求和期望。
 

该项目以非洲猪瘟为重点研究对象,研究非洲猪瘟病毒传染源、主要传播路径等流行病学规律及其遗传特性,创制具有良好安全性和免疫保护效果的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗,优化非洲猪瘟生物安全和综合防控技术体系,对保障我国养殖安全、食品安全和公共安全具有重要意义。

 

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非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技术研究进展

中国动物传染病学报,2018. 任名,郭晓宇,邬静,李金祥,朱鸿飞,陈鸿军.

 

2018年8月以前,国内无非洲猪瘟疫病例报告,但相关防控以及疫苗研制工作一直在推进。研究人员在免疫佐剂、弱毒疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗(P72、P30、P54、P12)方面已进行了大量的工作,但遗憾的是,临床试验结果显示这些疫苗均不能提供良好的保护效率。近期研究发现通过建立非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9基因敲除操作技术平台,将为非洲猪瘟病毒基因功能研究和毒力基因缺失的新型弱毒疫苗研究提供便捷的工具。

 

传统ASFV疫苗研究进展

目前国内外已经研制出ASFV的灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、同源重组弱毒疫苗以及其他新型疫苗,但这几种疫苗都存在不同程度的局限性。

 

1.灭活疫苗

灭活疫苗是最经典最早期的疫苗研制方式。非洲猪瘟病毒刚被发现时,研究人员就已开始研制灭活疫苗。然而,至今为止,使用或不使用佐剂都不能诱导机体产生有效保护性反应,经加热、复方碘溶液、甲苯、福尔马林、结晶紫、β-丙内酯、乙酰氮丙啶和缩水甘油醛处理的ASFV灭活疫苗虽部分能刺激猪产生抗体,但即使借助佐剂仍无法抵御ASFV的攻击。

 

2.亚单位疫苗

亚单位疫苗的研究策略主要是将具有中和表位的ASFV保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达,然后将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞,以诱导产生高滴度的抗ASFV中和抗体。ASFV编码的结构蛋白有很多。恢复期猪血清显示P72、P30和P54为感染过程中引起体液免疫应答最重要的3个抗原蛋白。针对P72和P54的抗体可以阻止病毒吸附,针对P30的抗体可以阻止病毒内吞。但目前大量研究结果显示,将这3个蛋白质作为ASF亚单位疫苗仅可提供部分保护或没有保护。

 

3.DNA疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗。作为新一代的疫苗研制方向,ASFV的相关研究工作也已经在开展。Argilaguet等利用真核表达质粒pCMV-PQ表达P30和P54,结果显示,该DNA疫苗免疫猪后无法抵御强毒株的攻击。随后,该实验室又进一步将ASFV血凝素蛋白基因和泛素基因(ubiquitin)连入上述DNA疫苗中,结果仍不能达到完全保护的功效。

 

4.同源重组弱毒疫苗

弱毒疫苗通常能赋予机体针对同源病毒的相对保护力,但针对异源病毒的保护力弱甚至没有保护力,同时弱毒疫苗还存在造成潜伏感染和毒力返强的可能性。对于弱毒疫苗的研制,同源重组一直是ASFV基因缺失的主导技术。但该方法的同源效率非常低,且需要经过多轮纯化才能去除野生型病毒。目前科学家们已利用同源重组技术成功构建了多种基因敲除的ASFV。重组致弱疫苗不仅可以提供良好的免疫保护,而且由于复制缺陷的特点,将显著降低疫苗毒株返强和毒副作用。然而,这类疫苗的动物实验仍停留在实验室阶段,由于大部分单一基因缺失毒株的毒力仍难以稳定致弱,至今很难应用于临床免疫防控。

 

5.细菌染色体组技术

由于ASFV的病毒DNA两端存在可变区,基因组DNA末端交叉连接成环形,病毒粒子含依赖于DNA的RNA多聚酶,而该聚合酶的亚基种类至今尚未全面了解。因此,至今难以在该病毒中使用细菌染色体组技术。

 

CRISPR/Cas9敲除技术在ASFV疫苗研究中的应用

 

1.CRISPR/Cas9敲除技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),被称为规律成簇间隔短回文重复,是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中类和类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motifs, PAM)结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单(5'-NGG-3'),几乎可以在所有基因中找到大量靶点。迄今为止,CRISPR/Cas9系统已广泛用于动、植物和微生物的基因组改造。科研人员已经使用CRISPR系统编辑了多种病毒,例如I型单纯疱疹病毒,Epstein-Barr病毒,伪狂犬病毒和牛痘病毒等。2018年,CRISPR/Cas9系统已开始用于非洲猪瘟病毒的基因组改造,且敲除效率得到显著提升。

 

2.CRISPR可以高效构建重组ASFV并易于重组病毒的纯化


ASFV对稳定细胞系适应后,会引起病毒基因组的大部分区域自发缺失,导致病毒毒力严重致弱,丧失对同源亲本毒株攻击的保护能力。因此,为了保持病毒基因组的稳定性,必须在猪巨噬细胞的原代细胞培养物中产生重组ASFV。重组ASFV的构建通常依靠通过靶向基因的两侧向ASFV导入含有同源重组臂的质粒,并用质粒中的报告基因取代靶向基因。这种同源重组方法,尤其是在猪巨噬细胞培养中进行的同源重组方案,重组效率非常低,野生病毒背景高,难以纯化重组ASFV,需要进行多轮空斑纯化或有限稀释。

 

2018年,Borca等采用CRISPR/Cas9诱导Cas9双链断裂ASFV基因组中8-DR的开放阅读框(open reading flame, ORF),在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAM)中从Georgia07毒株的基因组中删除非必需基因8-DR,并用红色荧光蛋白(red fluorecent protein, RFP)基因替代。敲入质粒中包含左臂8-DR ORF上游区域(72 169bp~73 369bp)和右臂8-DR ORF的下游区域(74 454bp~75 653bp),插入片段为RFP和Blasticidin基因(图1)。设计相关gRNAs,克隆入pCAS-Guide载体(来自Blue Heron Biotech公司)中。随后,在感染野生病毒的PAM细胞中,将两种8DR靶向gRNAs载体与敲入载体共转染,使用CRISPR/Cas9系统后,在转染后24 h,检测到约4log10 TCID50的重组ASFV。而对比传统的同源重组技术,获得的重组病毒低于滴定检测限(<0.5Log10TCID50),但通过细胞盲传,可以检测到荧光表达,获得重组病毒。这些结果表明使用CRISPR/Cas9比传统的同源重组技术的重组效率明显提升。该方法有效地构建ASFV重组病毒,通过对比试验发现,该技术相对于同源重组方法,能够显著提高重组ASFV,并易于重组病毒的纯化。结果表明,使用CRISPR技术编辑ASFV基因组已经成为了可能。

 

采用有限稀释法对CRISPR/Cas9敲除的ASFV Georgia病毒进行纯化,利用感染后荧光细胞来监测纯化,结果发现,使用CRISPR/Cas9系统明显增加重组病毒重组效率,比使用传统同源重组方法的纯化过程更容易,仅经过5次有限稀释,即可获得纯化子,这比使用传统的同源重组方法纯化ASFV所需的时间缩短很多。

 

3.pX330-ΔNLS1/2neoR载体构建以及稳定表达gRNA野猪肺细胞系建立

 

pX330-ΔNLS1/2neoR载体构建 为了鉴定和克隆ASFV基因组中合适的CRISPR/Cas9靶序列,需要构建合适的载体。有研究人员使用载体质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas920。该载体质粒最初被设计用于编辑哺乳动物基因组,在Cas9 ORF的两端编码核定位信号(nuclear localization signal, NLS)。由于ASFV主要在受感染细胞的细胞质中复制,因此需去除Cas9的NLS。在去除两端的NLS之后,插入新霉素抗性基因,从而构建获得pX330-ΔNLS1/2neoR载体。而NLS-less Cas9载体已被成功应用于痘苗病毒的定向突变。

 

稳定表达gRNA的野猪肺细胞系(wild boar lung cell line, WSL)建立  靶向P72和核酸酶的gRNA序列插入至pX330-ΔNLS1/2neoR载体中,将质粒分别转染野猪肺细胞系(WSL),新霉素抗性筛选细胞,通过Western blot、PCR和基因组DNA测序检测Cas9表达。结果表明,特异性gRNA在多次(>50)传代中稳定表达,且未发生Cas9核酸酶的脱靶反应。在该细胞系中,ASFV复制明显受到抑制。CRISPR/Cas9系统还有助于从病毒基因组中特异性地删除CP204L(P30)和其他必需的或非必需的ASFV基因。必需基因敲除时,为了避免病毒不能复制,可以通过共转染基因表达质粒的互补实验来姆弥补。该策略不仅有助于阐明病毒基因功能,也适合作为减毒或单循环活疫苗。非洲猪瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路,更多ASFV基因的敲除研究工作正在进行之中。

 

来源:综合科技部网站、中国动物传染病学报